Fmoc法多肽合成的主要问题来自Fmoc保护基¹。因为在脱除Fmoc的步骤中通常需要20%左右的哌啶溶液，这里会带来三个问题：第一，高浓度的哌啶溶液给后期溶剂回收带来难度，溶剂循环利用度低，导致环保压力大；第二，高浓度哌啶溶液的碱性很强，会带来一些已知或未知的副反应²，造成粗肽的纯度低，质量差。为了克服以上问题我们推出了Amoc多肽合成法。
    通过在Fmoc上引入烷酰基得到2-Alkanoyl-9-fluorenylmethoxycarbonyl（简称Amoc）保护基。Amoc保护的氨基酸的结构通式(Figure 1)如下：
                                                          
                                                                     Fig.1 Amoc保护氨基酸的结构

    与Fmoc多肽合成法比较，除了多肽偶联要求在中性、微碱性或微酸性的条件中进行外，使用Amoc-AA来合成多肽的工艺与传统的Fmoc多肽合成法类似。由于在Fmoc的2-引入中等吸电子能力的烷酰基，使得Amoc能够很容易用0.5%-2%的哌啶或哌嗪溶液来脱除，避开了Fmoc多肽合成法的很多问题，从而实现多肽绿色合成、提升多肽的粗品质量，降低多肽生产成本。
    通过大量Amoc法合成多肽的数据来看，以前用20%哌啶来脱Fmoc带来的副反应我们并没有发现或者无力解决。事实证明除偶联消旋之外，副反应主要发生在脱Fmoc这一步。以下是Amoc多肽合成法缓减副反应的一些案例：
用Fmoc-Gly-OH/HBTU//HOBt/DIEA的条件偶联将Gly逐个引入到H-Asn(Trt)-Gly-Wang PS resin上，在碱性偶联和20%哌啶DMF脱Fmoc的条件下，容易造成Gly增减的副反应。得到Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly的粗品纯度为25.1%。使用相同数量和取代度的H-Asn(Trt)-Gly-Wang PS resin,当采用Amoc-Gly-OH/DIC/Oxyma pure偶联，2%哌啶DMF脱Amoc，本产品的粗品纯度达到惊人的83.4%.[Fig. 2]
 
                                    
Fig 2: HPLC Chromatogram of crude Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly. A, Fmoc method. B, Amoc Method. HPLC condition: Kromasil 5μm C18 300 Å, 250×4.6 mm column; 0.1% TFA (v/v) in acetonitrile (solvent A), 0.1% TFA (v/v) in water (solvent B); gradient 5%-80% solvent A in 20 min, then 80%-100% solvent A in 20 min ; flow rate = 1.0   mL/min; detection wavelength = 210 nm.
 
 
    当序列中还有连续的Pro,或者Asp-Gly等容易产生副反应的情形，Amoc法均可以消除或者压制到合理范围。很多未知的反应，Fmoc法平常只是观察到为什么会有很多小毛峰，我们通过逐步偶联合成常规的14肽，发现Amoc与Fmoc法差异很大。[Fig. 3] 采用H-Leu-树脂通过逐步偶联的方法制备H-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr-Gly-Pro-Ala-Leu-OH. Amoc法采用DIC/Oxyma偶联，1%哌嗪脱除Amoc；Fmoc法也采用DIC/Oxyma偶联，换成20%哌啶脱除Fmoc。
                                             
Fig.3: HPLC Chromatogram of crude Peptide A. HPLC condition: Kromasil 5μm C18 300 Å, 250×4.6 mm column; 0.1% TFA (v/v) in acetonitrile (solvent A), 0.1% TFA (v/v) in water (solvent B); gradient 10%-100% solvent A in 30 min; flow rate = 1.0 mL/min; detection wavelength = 210 nm.
     Amoc法还实现了多肽绿色合成。多肽合成当中，绝大多数废弃物是废溶剂³。即使报道EtOAc/DMSO作为多肽溶剂可以实现部分溶剂回收，但是后处理麻烦，是否适应其它多肽的制备也不确定⁴。Amoc-AA用于多肽合成时，使用低浓度的有机碱来脱除Amoc，少量的有机碱容易被强阳离子交换树脂这样的固体酸吸附，脱除了有机碱的溶液再经过精馏，实现溶剂回收利用。如果是现在流行的Fmoc工艺，高浓度的有机碱除了会导致DMF变质外，将大量哌啶与DMF分离特别困难，同时产生大量的废液，导致环保压力很大。总之，无论采用哪种Fmoc合成策略，Amoc多肽合成方法均能方便溶剂回收利用。
    利用Amoc耐酸，在弱碱条件下容易被脱除的特性⁵，可以将其用于多肽纯化Fig. 2。多肽增长过程中对没有偶联完全的胺基进行封端，然后将最后一个Amoc保护的氨基酸偶联到多肽上去后，保留Amoc基团，当多肽裂解完成后，把胺端带有Amoc的多肽产品与没有Amoc的杂质通过制备柱纯化，胺端带有Amoc的多肽经过弱碱性溶液(比如1%哌啶)脱除Amoc保护基后[Table1]，再次进行反得到向制备柱纯化得到纯净的多肽[Fig.4]。HPLC上，产品峰附近存在杂质是色谱纯化最大的难点。多次重复纯化会导致生产成本大幅增加⁶，甚至纯化失败。
                                                      

                                                                      Fig. 4 Amoc 多肽纯化示意图
   
     对于缺失肽、插入肽等杂质，Amoc法纯化可能效果不明显。但是根据文献报道的结论可知⁷，当杂质和产品都带有Amoc时，Amoc与不同的空间结构上的基团之间的相互作用带来的差异，可能使差相异构体和缺失肽等杂质与产品在HPLC上得到分离。根据实际情况，引入Amoc后为去除特定杂质提供了一个解决方案。
             
                                                                Fig.5 胸腺法新片段-9粗品

胸腺法新片段-9的序列为：H-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-NH₂.
      当胸腺法新片段-9 被引入Amoc-01后，胸腺法新片段-9与Amoc-01-胸腺法新片段-9在HPLC上的保留时间相隔了约8分钟 Figure 4。从胸腺法新片段-9粗品和Amoc-01-胸腺法新片段-9的HPLC图明显看到胸腺法新片段-9粗品的主峰里面含有保留时间为11.368min这个杂质，而胸腺法新片段-9的保留时间为11.526min,用液相制备色谱法是很难将它与杂质分开的[Fig 5]。Amoc-01-胸腺法新片段-9与胸腺法新片段-9附近的杂质分离后，脱除Amoc-01,进行二次纯化，胸腺法新片段-9的纯度为99.3%.
Table 1. 不同Amoc在弱碱性环境中的脱除情况

碱	pH	Time(min)，25℃	脱除比例
0.1M NaOH	14	60	60%
0.1M LiOH	14	60	50%
1%哌啶	12-13	20	100%
1%哌嗪	12-13	20	100%
5%TEA	>14	60	<5%
15%碳酸钠	12-13	60	50%

Note: Amoc-Leu-Ala-Thr-Asp-Ala-OH的浓度为50mg/ml in water；
      Amoc-tagged多肽与杂质在制备色谱上容易分离，方便地实现多肽富集、减少纯化次数、尤其是第一轮制备色谱纯化时由于Amoc-tagged多肽与杂质的区分度大，可以把上样量做得很大，这样大幅降低了多肽纯化的溶剂使用量，同时提高了纯化效率，使得多肽纯化变得绿色。
Amoc对碱敏感，多肽偶联时要求体系的pH在中性附近。通常DIC/添加剂可以满足大部分的偶联，如果需要HBTU、PYBOP、T4P这类缩合剂，建议像HOBt这种类似的酸性添加剂尽量比有机碱多一些，而且偶联时最后加有机碱。容易消旋的氨基酸，比如，His、Cys、Asp、Ser不要预活化，不然会导致消旋程度偏高。
从原子经济性的角度来看，Amoc上的R₃为甲基最为合理。涉及到Amoc纯化,Amoc已经满足大部分的需求，某些情况下R₃为长链烷基（通常C15已经满足，这里的Amoc命名为Amoc-01,[Fig.6]）会带来意想不到的效果，比如，通过打浆就可以把杂质除去; 水溶性特别好的多肽引入Amoc-01,将会使纯化变得容易，不然纯化时上样都很困难。
阿拉宁专利产品[CN202511226897.4]Amoc和Amoc-01已经满足生产要求，如果有特别需求请联系我们定制。

                                                                               
                                                        Amoc                                                              Amoc-01
                                                                                                                   
                                                                            Fig.6. Amoc和Amoc-01的结构
 
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参考文献
1. Raymond, Behrendt; Peter, White; John Offer. Advances in Fmoc solid-phase peptide synthesis. Peptide Science. 2016, 22, 4-27.
2. Wenyi, Li; Neil M. O’Brien-Simpson; Mohammed Akhter, Hossain; John D,Wade. The 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) Group in Chemical Peptide Synthesis – Its Past, Present, and Future. Aust. J. Chem. 2020, 73, 271–276.
3. Ferrazzano, L.; Cavazzini, A.; et al. Sustainability in peptide chemistry: current synthesis and purification technologies and future challenges. Green Chemistry. 2022, 24, 975-1020.
4. Pawlas, J.; Rasmussen, J.H. ReGreen SPPS: enabling circular chemistry in environmentally sensible solid-phase peptide synthesis. Green Chemistry. 2019, 21, 5990-5998.
5. Shuangchun Xiang et al. A Class of Reagents for Separating Amines and Their Applications. CN202110045405.7
6. Farkas, Viktor; Ferentzi, Kristof; Horvati, Kata; Perczel, Andras. Cost-Effective Flow Peptide Synthesis: Metamorphosis of HPLC. Organic Process Research and Development, 2021, 25(2),182 – 191.
7. Miyazawa, T., et al. (1992). Racemization studies in peptide synthesis through the separation of protected epimeric peptides by reversed-phase high performance liquid chromatography. International Journal of Peptide and Protein Research, 1992,39(3), 299-306.